Identificación de proteínas efectoras mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF del nematodo agallador de la raíz Meloidogyne javanica

Abstract

La principal problemática del cultivo de vid son los nematodos agalladores de la raíz causan serios problemas en el rendimiento en la mayoría de cultivos en todo el mundo. A través de sus diferentes mecanismos de infección estos nematodos sintetizan y secretan una mezcla de efectores a base de compuestos proteicos que utilizan para penetrar la raíz, migrar y desarrollarse en células gigantes de alimentación radicular en las plantas hospederas. El uso de nuevas herramientas moleculares como la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight) y la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) han permitido conocer estas proteínas y genes en diferentes microorganismos. Objetivo: Caracterizar al nematodo agallador de la raíz Meloidogyne javanica mediante la secuenciación del gen ARNr 18S a partir de muestras radiculares infectadas y las proteínas efectoras de juveniles (J2) y adultas (J4) estadio de M. javanica mediante la espectrometría doble masa MALDI TOF/TOF de tipo shotgun proteomics. Metodología: Las raíces infectadas del cultivo de vid fueron colectadas para extraer agallas y J2 frescos de M. javanica, posteriormente se inocularon en plantas de tomate. Se utilizaron J4 de M. javanica para la extracción del ADN genómico y su secuenciamiento a nivel del gen ARNr 18S. Los estadios J2 y J4 de M. javanica, se desinfectaron con hipoclorito de sodio (0,5%) y agua destilada estéril, para la extracción y análisis de proteínas con MALDI-TOF/TOF. Por último, las secuencias obtenidas fueron procesadas con los softwares ProteinPilot™ y Protein BLAST para la identificación de proteínas efectores de M. javanica. Resultados: Se identificó molecularmente, a través de la amplificación por PCR del gen ADNr 18S al nemátodo M. javanica con un porcentaje de identidad de 98% a partir de muestras radiculares infectadas y mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF, se identificaron secuencias proteicas efectoras tales como: Beta-1,4-endoglucanas y polygalaturonasa, identificadas a partir de J2, y la expansin B2, CLAVATA3/ESR, Pectato lyasa y Chorismato mutasa a partir de J4, involucradas en los diversos procesos de infección. Además, se lograron identificar 49 proteínas no efectoras del nematodo en ambos estadios relacionadas al desarrollo biológico conservado. Implicaciones: Los resultados indican la existencia de proteínas efectoras relacionadas a la formación de agallas de la raíz. Conclusiones: Este estudio confirman que la metodología de espectrometría de doble masa proporciona de una forma rápida y reproducible un perfil proteómico que el nematodo agallador sintetiza para infectar las células radiculares y que puede ser usado en otros tipos de patógenos.